Pati resisten adalah fraksi pati yang tidak dapat dicerna karena bersifat resisten terhadap hidrolisis enzim dan memiliki fungsi yang sama dengan serat pangan. Pati resisten dapat dibentuk melalui proses pemanasan dan pendinginan. Sukun mengandung kadar pati yang cukup tinggi sehingga berpotensi untuk diubah menjadi fraksi pati resisten dalam pembuatan tepung sukun sebagai substitusi tepung terigu pada pembuatan cookies. Penggunaan puree labu kuning digunakan untuk mensubstitusi margarin untuk menurunkan kadar lemak cookies yang tinggi. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan karakteristik tepung sukun pramasak dan menganalisis pengaruh substitusi tepung sukun dan margarin terhadap karkateristik fisik, organoleptik, dan kimia cookies. Dalam penelitian ini digunakan 4 rasio tepung terigu : tepung sukun (1:0, 2:1, 1:1, 1:2) serta 2 rasio margarin : puree labu kuning (1:0, 1:1). Tepung sukun yang dibuat menggunakan metode pra-masak memiliki kadar pati resisten sebesar 1.190.05%. Uji organoleptic menunjukkan bahwa cookies yang dibuat dengan rasio tepung terigu tepung sukun sebesar 2:1 dan rasio margarin : puree labu kuning 1:1 memiliki karakteristik fisik paling mendekati kontrol dan lebih disukai oleh panelis. Berdasarkan karakteristik kimianya, substitusi tepung terigu dan labu kuning dapat menurunkan kadar lemak dan meningkatkan kadar pati resisten cookies.