Kulit kacang kedelai yang mengandung serat makanan seperti selulosa, hemiselulosa, dan lignin, merupakan hasil samping dari proses pengolahan kacang kedelai (Glycine max L. Merrill) menjadi tempe. Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan jenis asam dan konsentrasi yang optimum dalam proses hidrolisis, membuat media alternatif dari filtrat kulit kacang kedelai dengan pepton atau gula yang dapat mendukung pertumbuhan mikroorganisme uji (E. coli, S. thermophilus, S. cereviseae, C. albicans, R. oryzae, dan A. niger), serta mengetahui karakteristik media alternatif. Pada penelitian ini, hidrolisis dilakukan dengan dua jenis asam (HCl dan H2SO4) pada konsentrasi tertentu (0,5%, 1%, 1,5%, dan 2%). Hasil penelitian menunjukan bahwa hidrolisis menggunakan 2% H2SO4 merupakan perlakuan terpilih untuk menghasilkan filtrat kulit kacang kedelai dengan jumlah gula reduksi 5,02±0,021 mg/ml. Filtrat yang terpilih digunakan dalam pembuatan media alternatif dengan variasi konsentrasi (5%, 10%, 15%, dan 20%). Media alternatif untuk pertumbuhan bakteri ditambahkan pepton dengan konsentrasi tertentu (0%, 1%, dan 2%), sedangkan untuk pertumbuhan khamir dan kapang ditambahkan dengan gula pada konsentrasi tertentu (0%, 1%, dan 2%). Hasil penelitian menunjukan bahwa penambahan 2% pepton dan 20% filtrat merupakan formulasi media alternatif bakteri terpilih dengan jumlah E. coli 2,88 x 108 CFU/ml dan jumlah S. thermophilus 1,26 x 108 CFU/ml. Penambahan 2% gula dan 15% filtrat merupakan formulasi media alternatif khamir dan kapang yang terpilih dengan jumlah S. cereviseae 7,53 x 106 CFU/ml, jumlah C. albicans 7,60 x 106 CFU/ml, diameter pertumbuhan R. oryzae 44,74±0,113 mm, dan diameter pertumbuhan A. niger 25,66±0,019 mm. Media alternatif yang terpilih memiliki karakteristik (waktu pemadatan, suhu pemadatan, suhu cair, waktu kerusakan,Chroma, oHue, dan pH) yang sama seperti media komersial, kecuali nilai Chroma 5,90±0,163 dan nilai oHue 77,71o±0,361 media alternatif bakteri yang berbeda dengan warna media komersial MRSB.