Agar-agar merupakan polisakarida dengan berat molekul tinggi yang dihasilkan melalui ekstraksi dari alga merah seperti Gracilaria dan Gelidium (Rhodophyceae). Agar-agar dikenal menjadi salah satu bahan ekspor yang berperan penting sebagai agen pembentuk gel dalam industri makanan, sehingga produktivitas dan permintaan terhadap rumput laut penghasil agar-agar meningkat. Pemanfaatan agar-agar masih terbatas pada sifat kelarutan dan berat molekul agar-agar yang cukup tinggi sehingga masih sulit untuk dimanfaatkan lebih lanjut. Hidrogen peroksida merupakan salah satu agen pengoksidasi terkuat dan efektif digunakan untuk degradasi polisakarida. Peningkatan suhu menyebabkan proses degradasi polisakarida menjadi lebih cepat. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh konsentrasi hidrogen peroksida (0, 2, 4, dan 6%) dan suhu depolimerisasi (40, 60, dan 80C) berdasarkan analisis terhadap rendemen, kelarutan, bobot molekul, mikrostruktur dan gugus fungsional. Hasil analisis terhadap bobot molekul agar-agar hasil ekstraksi adalah sebesar 256,42 kDa ± 4,08. Kelarutan dari agar-agar hasil ekstraksi yakni sebesar 16,89 ± 0,05 kDa. Hasil menunjukkan peningkatan konsentrasi hidrogen peroksida dan suhu depolimerisasi secara nyata menghasilkan penurunan bobot molekul dan peningkatan kelarutan agar-agar hasil depolimerisasi. Perlakuan ini menyebabkan terjadinya perubahan terhadap mikrostruktur dan gugus fungsional agar-agar depolimerisasi. Perlakuan suhu tinggi 80oC pada konsentrasi 4 dan 6% justru menghasilkan peningkatan bobot molekul. Bobot molekul terendah dan kelarutan tertinggi agar-agar hasil depolimerisasi diperoleh melalui perlakuan suhu 60C dan konsentrasi hidrogen peroksida 6% dengan nilai masing-masing sebesar 153,84 kDa dan 80,71%.