N-asetilglukosamin (NAG) merupakan produk turunan yang dihasilkan dari hidrolisis cangkang udang windu (Penaus monodon) menggunakan enzim kitinase dari Mucor circinelloides. Enzim kitinase dapat digunakan berulang melalui imobilisasi enzim menggunakan matriks polimer agar sehingga stabilitas enzim dan kadar N-asetilglukosamin dapat ditentukan. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui konsentrasi agar dan jumlah enzim kitinase terbaik dalam fermentasi untuk menghasilkan N-asetilglukosamin dan untuk mengetahui stabilitas enzim kitinase pada pemakaian berulang. Penentuan konsentrasi agar dan jumlah kitinase dalam fermentasi enzim terimobilisasi dilakukan menggunakkan konsentrasi agar (3,4,5, dan 6%) dan jumlah enzim kitinase (0,2 mL, 0,4 mL, 0,6 mL, 0,8 mL, dan 1 mL). Pemakaian berulang (1 kali, 2 kali, 3 kali, dan 4 kali) enzim terimobilisasi dilakukan untuk mengetahui stabilitas enzim kitinase dalam menghasilkan N-asetilglukosamin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa imobilisasi enzim dengan konsentrasi agar 3 % dan jumlah enzim kitinase 0,6 mL menghasilkan kadar N-asetilglukosamin tertinggi (1111,667 ppm) dan menjadi kondisi terpilih untuk diaplikasikan dalam pemakaian berulang. Pemakaian enzim kitinase terimobilisasi pertama menghasilkan kadar Nasetilglukosamin tertinggi (1078,889 ppm), tetapi kadar N-asetilglukosamin pada pemakaian berulang kedua dan ketiga kali menurun. Kadar N-asetilglukosamin terendah dihasilkan pada pemakaian berulang 4 kali. Enzim kitinase terimobilisasi masih dapat digunakan hingga pemakaian keempat namun terjadi penurunan kadar N-asetilglukosamin pada setiap pemakaian berulang enzim kitinase terimobillisasi.