Streptococcus thermophilus adalah bakteri asam laktat (BAL) yang memiliki potensi probiotik dan ditemukan pada susu segar, keju, dan yogurt. Mikrobiota susu kambing mengandung beberapa BAL termasuk S. thermophilus, yang dapat digunakan sebagai kultur starter pembuatan produk susu. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan karakterisasi S. thermophilus dari susu kambing yangbelum dilakukan di Indonesia sampai saat ini. Isolasi dan karakterisasi S. thermophilus meliputi beberapa tahapan yaitu: isolasi dan pemurnian isolat, karakterisasi morfologi isolat, karakterisasi aktivitas biokimia, dan uji ketahanan isolat. Isolasi dimulai dengan inokulasi sampel susu yang sudah didilusi pada MRS agar dengan metode spread plate. Koloni yang tumbuh dimurnikan dengan streaking. Kemudian, isolat murni dikarakterisasi melalui pengamatan morfologi koloni dan sel. Pengamatan morfologi sel meliputi pewarnaan Gram, endospora, dan tahan asam. Uji aktivitas biokimia yang dilakukan adalah uji aktivitas katalase, uji aktivitas hemolitik, uji fermentasi 9 jenis gula (glukosa, fruktosa, sukrosa, laktosa, maltosa, manosa, mannitol, sorbitol, galaktosa). Kemudian dilakukan uji ketahanan isolat terhadap NaCl (2%, 4%, dan 6.5%), pH (2,3,4,5,6,7, dan 9,6) dan suhu (7°C dan 45°C). Dari hasil isolasi, dipilih 16 koloni dengan morfologi koloni yang sesuai. Namun, setelah pengamatan morfologi sel hanya terdapat 10 isolat yang merupakan kokus Gram positif, membentuk rantai, tidak menghasilkan endospora dan tidak terdapat lapisan lilin pada dinding sel. Setelah dilakukan karakterisasi aktivitas biokimia, diperoleh 2 isolat kandidat S. thermophilus dengan kode isolat T5.4 dan M4.4 yang tidak menghasilkan enzim katalase dan mampu memecah sebagian sel darah merah (alpha-hemolitik). Dari 2 isolat tersebut isolat T5.4 memiliki karakteristik yang mengarah pada S. thermophilus karena tidak tumbuh pada NaCl 4% dan 6.5%, tidak tumbuh pada pH 9.6 dan bertumbuh baik pada pH 7, tumbuh pada suhu 45°C dan tidak tumbuh pada suhu 7°C. Berdasarkan hasil penelitian, isolat T5.4 diduga sebagai S. thermophilus karena terdapat kesamaan karakteristik. Meskipun demikian, perlu dilakukan identifikasi molekuler menggunakan 16s rRNA untuk mengonfirmasi identitas isolat.