Latar Belakang: Antibiotik adalah salah satu jenis antimikroba yang digunakan untuk mengobati infeksi bakteri di dalam tubuh. Penggunaan antibiotik dapat dipengaruhi oleh pengetahuan mengenai antibiotik. Di Indonesia, terdapat banyak penelitian dengan hasil yang kontradiktif mengenai hubungan pengetahuan tentang antibiotik dengan perilaku dalam penggunaan antibiotik. Oleh karena itu, peneliti hendak mengetahui hubungan pengetahuan tentang antibiotik dan perilaku dalam penggunaan antibiotik pada mahasiswa angkatan 2020 UPH Tujuan Penelitian: Mengetahui hubungan antara pengetahuan tentang antibiotik dengan perilaku dalam penggunaan antibiotik pada mahasiswa angkatan 2020 UPH. Metode: Studi potong lintang ini diselenggarakan pada bulan Januari 2023 dengan menggunakan data primer. Kuesioner disebarkan kepada 177 orang mahasiswa angkatan 2020 UPH. Data disusun ke dalam Microsoft Excel dan dianalisa dengan SPSS Statistics menggunakan metode Chi Square, Fisher’s Exact, dan regresi logistik. Hasil: Dari 183 responden yang diteliti, terdapat 102 (55,6%) responden yang memiliki pengetahuan baik terkait antibiotik serta terdapat 101 (55,2%) responden yang berperilaku yang benar dalam penggunaan antibiotik. Kesimpulan: Terdapat hubungan yang signifikan antara pengetahuan dan perilaku dalam penggunaan antibiotik pada mahasiswa angkatan 2020 UPH dengan nilai p= 0,0001 pada uji Pearson Chi Square dan nilai p= 0,016 pada uji Fisher’s Exact (95% CI= 1,87-54,03). Kata Kunci: Antibiotik, pengetahuan, perilaku, penggunaan antibiotik. Referensi: 85 (2000-2022)/Background: Antibiotics is a type of antimicrobes that have been used to treat bacterial infection in the body. Antibiotics use can be influenced by the knowledge about antibiotics. In Indonesia, there are many studies with contradictive results about relationship between antibiotic knowledge and attitude in antibiotic use. Therefore, this study aims to know about level of knowledge and attitude regarding antibiotic use in students and to determine the relationship between knowledge about antibiotics and attitude in antibiotic use. Aim: To determine the relationship between knowledge about antibiotics and attitude regarding antibiotic use in class of 2020 UPH. Methodology: This analytic cross-sectional study was conducted in January 2023. The questionnares were distributed through social media to 177 students at UPH. The submitted data was arranged in Microsoft Excel and analyzed with SPSS Statistics using Chi Square, Fisher’s Exact, and Binary Logistic method. Result: From a total of 183 respondent, there are 102 (55,6%) respondent who have a good knowledge about antibiotic and 101 (55,2%) respondent who possess with good attitude in using antibiotic. Conclusion: The result denoted a significant correlation between knowledge and attitude regarding antibiotic use in class of 2020 UPH (p= 0,0001 in chi square method and p= 0,016 in Fisher’s Exact; 95% CI = 1,87- 54,03). Keywords: Antibiotics, knowledge, attitude, antibiotic use. Reference: 85 (2000-2022)