Data WHO (World Health Organization) menunjukkan bahwa Indonesia menduduki peringkat kedua untuk jumlah penderita TB terbanyak di dunia dan didominasi oleh orang dewasa dengan persentase sebesar 84.7%. Untuk menanggulangi hal ini, PT. Bio Farma melakukan pengembangan vaksin TB baru berbasis protein rekombinan dengan ESAT-6 dan Ag85c sebagai target antigen nya. Salah satu tahapan dalam pengembangan vaksin TB adalah purifikasi dengan menggunakan kromatografi afinitas. Pada salah satu tahapan untuk mengelusi antigen ESAT-6 dan Ag85c dari resin Ni-NTA, dibutuhkan senyawa imidazole untuk mengelusi. Namun keberadaan imidazole dapat terikut bersama dengan protein sehingga diperlukan kuantifikasi dalam mendeteksi imidazole. Dalam mengoptimalisasi adanya residual imidazole pada sampel Drug Substance (DS) dapat menggunakan metode elusi gradien pada flow rate 0.05 mL/menit dengan running time 45 menit dan terlihat bahwa imidazole dapat terpisah dari komponen lain tanpa terinterferensi oleh senyawa lain. Sehingga dalam hal ini, metode tersebut dijadikan sebagai patokan untuk memenuhi sejumlah parameter validasi metode. Sejumlah parameter validasi sudah memenuhi sesuai dengan guideline ICH Q2(R1), yakni spesifisitas bahwa metode spesifik terhadap analit dan tidak dipengaruhi oleh komponen lain,linearitas bahwa R2 0.9978,presisi 0.23%, akurasi 90% dan batas deteksi (LOD konsentrasi 0.025 ug/uL&LOQ 0.05 ug/uL)./WHO (World Health Organization) data shows that Indonesia ranks second for the number of TB sufferers in the world and is dominated by adults with a percentage of 84.7%. To overcome this, PT. Bio Farma is developing a new TB vaccine based on recombinant protein with ESAT-6 and Ag85c as its target antigens. One of the stages in developing a TB vaccine is purification using affinity chromatography. In one of the stages to elute the ESAT-6 and Ag85c antigens from Ni-NTA resin, imidazole compounds are needed to elute. However, the presence of imidazole can be carried along with the protein so that quantification is needed to detect imidazole. In optimizing the presence of residual imidazole in Drug Substance (DS) samples, the gradient elution method can be used at a flow rate of 0.05 mL/minute with a running time of 45 minutes and it can be seen that imidazole can be separated from other components without interference by other compounds. So in this case, this method is used as a benchmark to meet a number of method validation parameters. A number of validation parameters have met the ICH Q2(R1) guidelines, which are specificity the validation is specific that analyte couldn’t interfere any components in the matrixs , linearity R20.9978, precision 0.23%, accuracy 90%, and limit of detection (LOD on concentration 0.025 ug/uL &LOQ on concentration 0.05 ug/uL).