Susu sapi adalah salah satu produk hasil ternak yang cukup populer. Nutrisi didalam susu sapi merupakan habitat yang baik untuk pertumbuhan beberapa bakteri asam laktat kategori starter culture yang berperan bagi industri di bidang fermentasi pangan. Namun penelitian terkait starter culture masih terbatas di Indonesia. Isolasi dan seleksi awal (morfologi koloni, pewarnaan Gram, uji katalase, endospora, dan acid fast) dilakukan terhadap bakteri kandidat L. delbrueckii dan S.thermophilus. Karakterisasi biokimia seperti perlakuan suhu 10°C dan 45°C, ujikonsentrasi garam 2%, 4%, dan 5%, uji fermentasi gula (glukosa, fruktosa,laktosa, maltosa, sukrosa, rafinosa, sorbitol, dan manitol), serta uji hemolitikdilakukan terhadap bakteri kandidat. Identifikasi molekuler 16S rRNA dilakukanuntuk mengetahui identitas bakteri. Uji suseptibilitas dengan 23 jenis antibiotik(disc diffusion) dilakukan terhadap bakteri kandidat. Bakteri diaplikasikan dalampembuatan yogurt yang diikuti dengan uji organoleptik. S.thermophilus DRZ24/S1 dan L. delbrueckii. DRZ94/L4 yang berhasildiisolasi, diklasifikasi berdasarkan Bergey’s Manual. Keduanya didominasi sifat suseptibel terhadap antibiotik dengan tidak terdeteksinya keberadaan plasmid setelah proses ekstraksi. Kedua bakteri berpotensi sebagai starter culture dalam pembuatan yogurt dengan waktu inkubasi 9,5 jam. Skor indeks pengujian organoleptik dibandingkan menggunakan yogurt dari starter culture komersial oleh 30 volunter dengan perolehan hasil 4,93+0,45 dari 7 (non-komersial) dan 4,76+0,30 dari 7 (komersial).